线粒体


1. 线粒体纯度和结构完整性的快速表征


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实验简介

线粒体是细胞的能量工厂,在真核细胞的进化中发挥着重要作用。此外,线粒体还与细胞内的信号转导密切相关,如自噬、细胞死亡、自然免疫等。多种复杂的人类疾病都是由线粒体的功能异常导致的,包括神经退行性疾病和新陈代谢紊乱。因此,线粒体研究对于基础生命科学研究意义重大。传统流式细胞仪因缺乏足够的灵敏度,在单个线粒体的分析检测方面仍然受到很大的限制。

在纳米流式检测装置上,分别采用NAO和SYTO 62 对线粒体内膜上的心磷脂和基质中线粒体核酸(mtDNA)进行特异性标记,通过对单个线粒体的散射、内膜心磷脂、mtDNA的同时检测可实现线粒体的纯度和内膜结构完整性的考察;通过外膜穿孔蛋白(porin)蛋白和膜间隙cyt c蛋白的同时检测能够对线粒体的外膜和功能的完整性进行快速表征。


仪器与试剂

纳米流式检测装置,选用波长为488 nm的激光器,检测通道分别为散射通道、FITC荧光通道和APC荧光通道。


实验结果

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结果分析

1.结合线粒体内膜特异性蛋白标记与mtDNA染色,纳米流式检测装置检测通过对单个线粒体的散射、内膜心磷脂、mtDNA 的同时检测可实现线粒体的纯度和内膜结构完整性的考察。

2.纳米流式检测装置通过对单个线粒体的散射、外膜穿孔蛋白(porin)和膜间隙cyt c 蛋白的同时检测能够对线粒体的外膜和功能的完整性进行准确的考察。

3.在单线粒体水平表征结构完整性、进行蛋白核酸的检测,将为线粒体介导的细胞凋亡信号转导研究提供先进的分析手段。

Anal. Chem. 2012, 84, 6421-6428.


 

2.膜电位检测与靶向线粒体抗癌药物的筛选


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实验简介

以线粒体为靶点的抗癌药物能够通过引发线粒体外膜通透性的改变直接启动细胞凋亡进程,规避细胞耐药机制,是抗肿瘤靶向性药物设计的新途径。采用线粒体膜电位探针DiOC6(3)对线粒体进行荧光染色,通过测定药物作用前后线粒体膜电位、内部颗粒性以及完整线粒体数量的变化,发展靶向线粒体抗肿瘤药物的快速筛选方法,准确地鉴定药物能否直接作用于线粒体以及作用的强弱程度。氰基-对-氯苯腙(CCCP)能有效导致线粒体膜电位下降,作为阳性对照。


仪器与试剂

纳米流式检测装置,选用波长为488 nm的激光器,检测通道分别为散射通道和FITC荧光通道。


实验结果

 

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图1. 纳米流式检测装置分析三种抗癌药物作用的线粒体

 

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图2. 药物浓度度对线粒体膜电位的影响


结果分析

1.纳米流式检测装置可以通过膜电位探针DiOC6(3)来检测线粒体膜电位的变化情况。
2.该方法能够该方法能快速、准确地鉴定药物是否直接作用于线粒体以及作用的效果。
3.为研究抗癌药物的作用机理和药物筛选提供了一种新方法。
 

Anal. Chem. 2014, 86, 5232-5237.


 

3.单线粒体水平蛋白拷贝数及其分布的测定

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实验简介

线粒体通过其表面或内部的各种蛋白直接参与并调控多种细胞生命活动,对线粒体的各种蛋白进行快速、准确的定量表征有助于研究线粒体的作用和调控过程。对线粒体蛋白进行免疫荧光标记,借助荧光当量已知的荧光标准球,可以获得单个线粒体Bcl-2家族蛋白的拷贝数及其统计分布。

仪器与试剂


纳米流式检测装置,选用波长为488 nm的激光器,检测通道分别为散射通道、FITC荧光通道和APC荧光通道。

实验结果


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图1. 纳米流式检测装置对单个荧光双染的线粒体的分析

 
 
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图2. 纳米流式检测装置对单个线粒体Bcl-2拷贝数的定量检测


结果分析

1.用核酸染料SYTO 62对线粒体进行染色可以确保测到的信号来源于完整的线粒体。
2.用荧光当量已知的荧光标准球绘制标准工作曲线,可获得单个线粒体Bcl-2蛋白家族的拷贝数及其统计分布。

Biosens. Bioelectron. 2015, 74, 476-482.